NHE-6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-404829-ACT-2

O gene humano SLC9A6 codifica o trocador endossomal de Na⁺/H⁺ NHE-6, um transportador de membrana que regula o pH luminal e a homeostase iónica nos endossomas precoces e de reciclagem. Ao controlar a acidificação endossomal, o NHE-6 influencia o tráfego de recetores, a triagem de carga e processos de transdução de sinal acoplados à endocitose e ao transporte vesicular, com efeitos a jusante no desenvolvimento neuronal e na função sináptica. A desregulação ou variantes de perda de função em SLC9A6 estão associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos, tornando o NHE-6 um alvo relevante para estudar a dinâmica do pH endossomal, as vias de tráfego de membrana e as relações genótipo–fenótipo. A edição genética de SLC9A6 em modelos celulares humanos permite a investigação funcional da sinalização dependente de endossomas, da reciclagem de proteínas e das respostas ao stress celular associadas a alterações no equilíbrio ácido–base dos organelos.

NHE-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC9A6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NHE-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC9A6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC9A6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NHE-6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC9A6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NHE-6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NHE-6 em células tumorais com expressão de SLC9A6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.