NFKBIA/IkB alpha Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400034-ACT

NFKBIA codifica a IκBα, um dos principais inibidores citoplasmáticos de NF-κB, que se liga a complexos RELA/p50 e restringe sua translocação nuclear em condições basais. Após estímulo por citocinas, ligantes de receptores do tipo Toll (TLR) ou sinais de estresse, a IκBα é fosforilada pelo complexo IKK, ubiquitinada e degradada, permitindo a rápida transcrição dependente de NF-κB de programas inflamatórios, imunes e de sobrevivência. NFKBIA também participa do controle por retroalimentação negativa, pois é ele próprio um gene-alvo de NF-κB, ajudando a redefinir a atividade da via após a sinalização. A expressão desregulada de NFKBIA ou alterações no turnover de IκBα têm sido associadas à inflamação crônica, desregulação imune e biologia tumoral impulsionada por NF-κB, tornando-o um nó comum em estudos de sinalização inata e de decisões de destino celular.

NFKBIA/IkB alpha O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NFKBIA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NFKBIA/IkB alpha O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NFKBIA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NFKBIA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NFKBIA/IkB alpha. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NFKBIA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NFKBIA/IkB alpha no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NFKBIA/IkB alpha em células tumorais com expressão de NFKBIA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.