NELF-B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405667-ACT

O gene humano **NELFB** codifica a **NELF-B**, uma subunidade central do complexo **Fator de Elongação Negativa (NELF)**, que coopera com o **DSIF** para impor a pausa proximal ao promotor da **RNA polimerase II** e moldar as etapas iniciais da elongação da transcrição. Ao regular a liberação da pausa e a cinética transcricional, a NELF-B influencia programas gênicos responsivos a estímulos, a comunicação entre enhancers e promotores e um controle mais amplo da expressão gênica ligado à cromatina. A pausa dependente de NELF está estreitamente conectada a vias que governam a progressão do ciclo celular, a diferenciação e respostas ao estresse, tornando a função de **NELFB** relevante para estudos mecanísticos de desregulação transcricional. Alterações na regulação do controle de elongação têm sido implicadas em diversos contextos de doença, sustentando o uso da perturbação de **NELFB** para modelar como a dinâmica de pausa impacta fenótipos a jusante.

NELF-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NELFB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NELF-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NELFB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NELFB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NELF-B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NELFB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NELF-B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NELF-B em células tumorais com expressão de NELFB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.