NEDD4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421848-ACT

O gene Nedd4 de camundongo codifica a NEDD4, uma ligase E3 de ubiquitina com domínio HECT que regula a renovação de proteínas e a amplitude da sinalização ao catalisar a ubiquitinação de receptores de membrana, canais iônicos e adaptadores intracelulares. Por meio de seus domínios WW, a NEDD4 reconhece substratos que contêm o motivo PY e interage com vias de endocitose e direcionamento lisossomal, moldando o tráfego de receptores e as redes de sinalização a jusante. A atividade da NEDD4 influencia as cascatas PI3K–AKT, TGF-β e outras ligadas a fatores de crescimento, com efeitos amplos sobre proliferação celular, diferenciação e respostas ao estresse. A desregulação da sinalização de ubiquitina dependente de NEDD4 tem sido associada a alterações na homeostase tecidual e a fenótipos relevantes para a biologia do câncer, regulação imune e processos do neurodesenvolvimento em modelos experimentais.

NEDD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Nedd4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NEDD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Nedd4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Nedd4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NEDD4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Nedd4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NEDD4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NEDD4 em células tumorais com expressão de Nedd4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.