Ndfip1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403470-ACT

NDFIP1 (Ndfip1) codifica uma proteína adaptadora endossomal que interage com ligases E3 de ubiquitina do tipo HECT da família NEDD4 e ajuda a acoplar proteínas de membrana à ubiquitinação, ao tráfego intracelular e ao seu turnover. Por meio da regulação da triagem dependente de ubiquitina, a Ndfip1 contribui para o controle da intensidade da sinalização de receptores, da dinâmica endossomal e de vias de proteostase que moldam estados celulares imunes e responsivos ao estresse. Alterações na atividade de NDFIP1 têm sido implicadas em sinalização inflamatória desregulada e na homeostase imune, tornando-a relevante para estudos mecanísticos de adaptação de sinalização e do controle de vias mediadas por ubiquitina. Em modelos de células humanas, a modulação da expressão de NDFIP1 é usada para investigar como o direcionamento de ligases E3 influencia programas transcricionais a jusante e fenótipos celulares ligados à regulação imune.

Ndfip1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NDFIP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ndfip1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NDFIP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NDFIP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ndfip1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NDFIP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ndfip1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ndfip1 em células tumorais com expressão de NDFIP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.