NBC4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412900-ACT

O SLC4A5 humano codifica o cotransportador eletro-neutral de bicarbonato de sódio NBC4, um transportador de membrana que medeia o fluxo de HCO₃⁻ acoplado a Na⁺ para sustentar a regulação do pH intracelular, a homeostase do bicarbonato e o transporte iónico epitelial. Ao moldar a capacidade tamponante citosólica e o movimento transepitelial de bicarbonato, o NBC4 contribui para processos como o manuseamento de eletrólitos nos rins e no intestino e as respostas celulares ao stress ácido–base. Alterações na atividade do SLC4A5 têm sido investigadas no contexto de desregulação do transporte iónico e de sinalização dependente de pH, que pode influenciar a excitabilidade, o metabolismo e a homeostase dos tecidos. Estas propriedades tornam o SLC4A5 um alvo útil para estudar a biologia dos transportadores da família SLC, a energética do transporte de membrana e vias regulatórias ligadas ao pH.

NBC4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC4A5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NBC4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC4A5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC4A5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NBC4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC4A5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NBC4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NBC4 em células tumorais com expressão de SLC4A5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.