N-Shc CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401571-ACT

SHC3 kodiert das neuronale Adapterprotein N‑Shc, ein Mitglied der Shc-Familie, das aktivierte Rezeptor-Tyrosinkinasen mit intrazellulären Signalkaskaden koppelt. N‑Shc ist an der Signalübertragung von Neurotrophinen und Wachstumsfaktoren beteiligt, indem es Rezeptoren wie Trk und EGFR mit nachgeschalteten Ras/MAPK- und PI3K/AKT-Signalwegen verbindet und so neuronale Differenzierung, Überleben und synaptische Plastizität mitprägt. Über seine PTB- und SH2-Domänen integriert N‑Shc phosphorylierungsabhängige Interaktionen, die die Zytoskelettdynamik und das Neuritenauswachsen beeinflussen. Veränderte SHC3-Signalgebung wurde mit fehlregulierten neuronalen Signalprogrammen in Modellen neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen sowie in ausgewählten Kontexten mit einer onkogenen Umverdrahtung von Signalwegen in Verbindung gebracht.

N-Shc Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SHC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

N-Shc Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SHC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SHC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen N-Shc-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SHC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von N-Shc-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des N-Shc-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SHC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.