Myo-inositol oxygenase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403646-ACT

O MIOX humano codifica a mio-inositol oxigenase, uma enzima di-ferro não heme que catalisa a primeira etapa comprometida do catabolismo do mio-inositol ao converter mio-inositol em ácido D-glucurônico. Essa atividade conecta o metabolismo do inositol à via do glucuronato/xilulose e ao processamento mais amplo de carboidratos, influenciando o equilíbrio redox celular e o fluxo metabólico. A expressão de MIOX é enriquecida em células do túbulo proximal renal e é frequentemente estudada no contexto da fisiologia renal, de respostas a estresse metabólico e de vias de sinalização dependentes da disponibilidade de inositol. A atividade desregulada de MIOX e seu controle transcricional têm sido associados a mecanismos relevantes em modelos de lesão renal diabética e a fenótipos relacionados ao estresse oxidativo em células renais.

Myo-inositol oxygenase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MIOX sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Myo-inositol oxygenase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MIOX em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MIOX, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Myo-inositol oxygenase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MIOX nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Myo-inositol oxygenase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Myo-inositol oxygenase em células tumorais com expressão de MIOX silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.