MTHFD2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403474-ACT

O MTHFD2 humano codifica uma desidrogenase/ciclo-hidrolase mitocondrial dependente de NAD de metilenotetraidrofolato que sustenta a rede de um carbono mediada pelo folato. Essa enzima contribui para a produção mitocondrial de formiato e para o equilíbrio redox, fornecendo assim unidades de um carbono para a biossíntese citosólica de nucleotídeos e para reações de metilação essenciais em células em proliferação. A atividade do MTHFD2 está intimamente ligada ao metabolismo de serina–glicina, à síntese de purinas e timidilato e às respostas ao estresse mitocondrial. A expressão desregulada de MTHFD2 é frequentemente associada a estados metabólicos alterados no câncer e em outras patologias ligadas à proliferação, tornando-o um ponto útil para estudar a reprogramação metabólica e o controle do crescimento.

MTHFD2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTHFD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MTHFD2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTHFD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTHFD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MTHFD2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTHFD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MTHFD2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MTHFD2 em células tumorais com expressão de MTHFD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.