MSK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401633-ACT

RPS6KA5 codifica a quinase ativada por mitógenos e por estresse 1 (MSK1), uma quinase nuclear de serina/treonina posicionada a jusante da sinalização de ERK1/2 e p38 MAPK. A MSK1 fosforila reguladores transcricionais como CREB e ATF1 e modifica a cromatina ao fosforilar a histona H3, acoplando assim sinais extracelulares a programas de expressão de genes de resposta imediata (immediate-early). Por meio dessas funções, a MSK1 contribui para o controle, dependente de estímulo, da proliferação, diferenciação, regulação de genes inflamatórios e respostas ao estresse celular. A desregulação da sinalização MAPK–MSK1 tem sido associada a perfis transcricionais alterados observados em contextos relacionados à inflamação e ao câncer, tornando o RPS6KA5 um nó útil para estudos mecanísticos de regulação gênica direcionada por vias de sinalização.

MSK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RPS6KA5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MSK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RPS6KA5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RPS6KA5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MSK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RPS6KA5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MSK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MSK1 em células tumorais com expressão de RPS6KA5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.