MLH3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404188-ACT

O MLH3 humano codifica um homólogo de MutL que atua no reparo de incompatibilidades do DNA (mismatch repair) e na recombinação meiótica, funcionando em conjunto com outros membros da família MutL para coordenar o reconhecimento de lesões com as etapas posteriores de reparo e a formação de crossovers. O MLH3 contribui para a estabilidade do genoma ao modular os desfechos do reparo em incompatibilidades associadas à replicação e em intermediários de recombinação, impactando a carga mutacional e a integridade cromossômica. Alterações na atividade ou na expressão de MLH3 têm sido associadas à instabilidade genômica relacionada ao mismatch repair e vêm sendo investigadas no contexto da suscetibilidade ao câncer e da biologia de expansão de repetições. Como fator nuclear de reparo, o MLH3 é comumente estudado por seus papéis na sinalização da resposta a danos no DNA, na fidelidade da replicação e na escolha de vias de recombinação.

MLH3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MLH3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MLH3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MLH3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MLH3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MLH3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MLH3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MLH3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MLH3 em células tumorais com expressão de MLH3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.