MIB1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404769-ACT

O MIB1 humano codifica a mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1, uma ligase E3 de ubiquitina que promove a ubiquitinação e a endocitose de ligantes de Notch, como JAG1 e proteínas DLL, permitindo assim uma ativação produtiva do receptor Notch. Por meio da regulação do tráfego de ligantes e da competência de sinalização receptor–ligante, o MIB1 influencia decisões de destino celular, diferenciação e padronização tecidual em contextos de desenvolvimento e de homeostase. A atividade do MIB1 se integra a processos de proteostase dependentes de ubiquitina e a vias de triagem endocítica, moldando as saídas transcricionais a jusante da sinalização de Notch. A desregulação do eixo MIB1/Notch tem sido associada a alterações na neurogênese, a fenótipos do desenvolvimento cardiovascular e a estados de sinalização oncogênica, o que motiva estudos mecanísticos em diversos modelos celulares.

MIB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MIB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MIB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MIB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MIB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MIB1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MIB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MIB1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MIB1 em células tumorais com expressão de MIB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.