Metallothionein 4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-413667-ACT

MT4 codifica a metalotioneína 4, uma proteína de ligação a metais rica em cisteína que contribui para o tamponamento celular de zinco e cobre e para a proteção contra a toxicidade de metais pesados por meio do sequestro baseado em grupos tiol. Como parte da família das metalotioneínas, a Metalotioneína 4 auxilia a homeostase redox ao limitar o estresse oxidativo catalisado por metais e pode influenciar programas transcricionais responsivos a metais, incluindo vias reguladas por MTF1. A expressão de MT4 é enriquecida em contextos epiteliais estratificados, nos quais a disponibilidade de metais e o equilíbrio oxidativo moldam a diferenciação e a integridade da barreira. Alterações na sinalização de metalotioneínas e na desregulação da homeostase de metais são frequentemente exploradas em estudos de respostas epiteliais ao estresse, remodelamento tecidual associado à inflamação e toxicologia relacionada a metais.

Metallothionein 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MT4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Metallothionein 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MT4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MT4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Metallothionein 4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MT4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Metallothionein 4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Metallothionein 4 em células tumorais com expressão de MT4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.