Metallothionein 2A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410889-ACT

MT2A codifica a metalotioneína 2A, uma proteína rica em cisteína que se liga a metais e que atua como tampão intracelular de zinco e cobre, sequestra metais pesados tóxicos como o cádmio e ajuda a manter a homeostase redox celular. Ao regular a disponibilidade de metais, a MT2A influencia programas transcricionais dependentes de metais e respostas antioxidantes, fazendo interseção com a sinalização de estresse e processos de desintoxicação. A expressão de MT2A é induzível por estresse oxidativo, sinais inflamatórios e exposição a metais, conectando-a a vias que governam a sobrevivência celular e a adaptação a agressões ambientais. A desregulação da biologia das metalotioneínas tem sido associada a alterações no metabolismo de metais e na tolerância ao estresse observadas em diferentes cânceres, em contextos neurodegenerativos e em modelos de lesão hepática, tornando a MT2A um nó útil para estudos mecanísticos de sinalização responsiva a metais.

Metallothionein 2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MT2A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Metallothionein 2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MT2A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MT2A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Metallothionein 2A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MT2A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Metallothionein 2A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Metallothionein 2A em células tumorais com expressão de MT2A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.