MEL-1A-R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401075-ACT

MTNR1A codifica o receptor de melatonina 1A (MEL-1A-R), um GPCR acoplado a Gi/o que medeia respostas celulares à melatonina tanto em tecidos centrais quanto periféricos. A ativação do receptor normalmente suprime a atividade da adenilato ciclase, modula a sinalização de cAMP/PKA e pode influenciar vias ligadas a MAPK/ERK e PI3K, moldando programas transcricionais que coordenam o timing circadiano e a regulação neuroendócrina. A sinalização de MTNR1A contribui para o controle dos ritmos sono–vigília, a função do eixo reprodutivo e a homeostase metabólica, estando a expressão alterada ou a sinalização do receptor associadas a fenótipos de desalinhamento circadiano e a contextos de pesquisa relacionados a doenças neuropsiquiátricas e metabólicas. Como receptor de membrana com saídas de sinalização dependentes de ligante bem definidas, MTNR1A é frequentemente utilizado para dissecar o acoplamento de vias de GPCR, a dessensibilização/internalização do receptor e redes de genes controladas pelo relógio biológico.

MEL-1A-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MTNR1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MEL-1A-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MTNR1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MTNR1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MEL-1A-R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MTNR1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MEL-1A-R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MEL-1A-R em células tumorais com expressão de MTNR1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.