MEK-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400397-ACT

MAP2K1 codifica a MEK-1, uma quinase de dupla especificidade que fosforila e ativa ERK1/2 dentro da cascata canónica de MAPK RAS–RAF–MEK–ERK. A MEK-1 integra sinais de recetores tirosina-quinase e de GTPases da família RAS para regular a proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e programas de transcrição dependentes de estímulos. Um controlo rigoroso da atividade e da expressão da MEK-1 é essencial para a progressão adequada do ciclo celular e para a regulação por feedback nas redes de sinalização MAPK. A desregulação da sinalização MAP2K1/MEK-1 é frequentemente estudada em contextos de ativação oncogénica da via MAPK, perturbações do desenvolvimento e mecanismos de reconfiguração adquirida da sinalização.

MEK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MAP2K1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MEK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MAP2K1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MAP2K1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MEK-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MAP2K1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MEK-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MEK-1 em células tumorais com expressão de MAP2K1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.