megalin/LRP2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401094-ACT

LRP2 codifica a megalina, um receptor endocítico multiligante da família dos receptores de LDL, altamente expresso em epitélios absortivos e que medeia a internalização dependente de clatrina de diversos ligantes proteicos, vitaminas e complexos hormônio–proteína carreadora. A megalina/LRP2 coordena a captação mediada por receptor e o tráfego para endossomos e lisossomos, contribuindo para a polaridade epitelial, a homeostase de nutrientes e a depuração de proteínas extracelulares, e se cruza funcionalmente com vias que envolvem cubilina/AMN, o manejo de albumina e da proteína ligadora de vitamina D e ligantes associados a lipoproteínas. No sistema nervoso e em outros tecidos, a LRP2 tem sido associada à regulação de sinalização por morfógenos, incluindo a modulação da disponibilidade de Sonic hedgehog e de BMP durante o desenvolvimento. A disrupção genética ou funcional de LRP2 está associada a fenótipos sindrômicos do desenvolvimento e a defeitos na reabsorção tubular renal de proteínas, tornando-a relevante para estudos de transporte epitelial, sinalização do desenvolvimento e tráfego de receptores.

megalin/LRP2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LRP2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

megalin/LRP2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LRP2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LRP2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de megalin/LRP2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LRP2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de megalin/LRP2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via megalin/LRP2 em células tumorais com expressão de LRP2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.