Med28 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407371-ACT

O MED28 humano codifica a Med28, uma subunidade do complexo Mediator que contribui para a transcrição dependente da RNA polimerase II e coordena programas de expressão gênica responsivos a sinais. A Med28 tem sido associada à regulação da adesão celular e da dinâmica do citoesqueleto por meio de interações que conectam o controle transcricional a vias como MAPK/ERK e a sinalização associada a integrinas. Alterações na expressão de MED28 foram relatadas em múltiplos conjuntos de dados relacionados ao câncer e são estudadas quanto à sua relação com proliferação, migração e estados transcricionais adaptativos ao estresse. Como co-regulador transcricional, a Med28 oferece um ponto de entrada útil para dissecar o controle dependente do Mediator sobre redes gênicas em modelos de desenvolvimento e de doença.

Med28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MED28 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Med28 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MED28 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MED28, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Med28. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MED28 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Med28 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Med28 em células tumorais com expressão de MED28 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.