MCT3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403973-ACT

SLC16A8 codifica il trasportatore di monocarbossilati 3 (MCT3), un trasportatore accoppiato ai protoni che media il flusso transmembrana di lattato e di altri monocarbossilati a corta catena, sostenendo l’equilibrio redox cellulare e l’omeostasi del pH. L’attività di MCT3 contribuisce all’accoppiamento metabolico tra cellule facilitando la gestione del lattato e si integra con il metabolismo glicolitico e ossidativo, influenzando l’acidificazione intracellulare e la disponibilità di substrati energetici. Nell’occhio umano, SLC16A8 è arricchito nell’epitelio pigmentato retinico, dove supporta l’efflusso di lattato dalla retina esterna e aiuta a mantenere il microambiente metabolico dei fotorecettori. Varianti genetiche e alterazioni dell’espressione di SLC16A8 sono state associate, in studi genetici sull’uomo, a fenotipi di degenerazione retinica e a un aumento del rischio di degenerazione maculare legata all’età, motivando indagini meccanicistiche sul trasporto del lattato nella salute della retina e nelle risposte allo stress.

MCT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC16A8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MCT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC16A8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC16A8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MCT3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC16A8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MCT3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MCT3 nelle cellule tumorali con espressione di SLC16A8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.