MCR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400672-ACT

NR3C2 codifica o receptor mineralocorticoide (MCR), um fator de transcrição de receptor nuclear ativado por ligante que responde principalmente à aldosterona e participa da sinalização de glicocorticoides de maneira dependente do tecido. Após a ativação, o MCR transloca-se para o núcleo e liga-se a elementos de resposta hormonal para regular genes que controlam o transporte epitelial de sódio, a homeostase do potássio, o equilíbrio de fluidos e a regulação da pressão arterial, incluindo vias que convergem para a atividade do ENaC e da Na⁺/K⁺-ATPase. A sinalização de NR3C2 também se cruza com programas gênicos inflamatórios e fibróticos em tecidos cardiovasculares, renais e neurais por meio de crosstalk específico do contexto com MAPK e outros reguladores transcricionais. A desregulação ou mutação de NR3C2 está implicada em distúrbios do manejo de sal e do controle da pressão arterial e é estudada em mecanismos de doença renal e cardíaca, na neurobiologia responsiva ao estresse e na regulação endócrina.

MCR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NR3C2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MCR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NR3C2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NR3C2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MCR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NR3C2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MCR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MCR em células tumorais com expressão de NR3C2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.