MBD3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401072-ACT

O MBD3 humano codifica a proteína 3 com domínio de ligação a metil-CpG, um componente central do complexo NuRD (remodelamento de nucleossomos e desacetilase) que integra o remodelamento de cromatina dependente de ATP com a desacetilação de histonas para regular programas transcricionais. O MBD3 contribui para o controle epigenético da identidade celular, incluindo diferenciação e transições de pluripotência, ao coordenar a repressão e/ou o “poising” gênico em promotores e enhancers e ao influenciar a acessibilidade da cromatina. Por meio de seu papel na organização da cromatina, o MBD3 se conecta a vias que governam respostas a danos no DNA, o timing de replicação e redes gênicas do desenvolvimento. A atividade desregulada de NuRD/MBD3 tem sido associada a estados transcricionais aberrantes no câncer e a fenótipos do neurodesenvolvimento, tornando-o relevante para estudos de mecanismos epigenéticos subjacentes a alterações de expressão gênica associadas a doenças.

MBD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MBD3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MBD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MBD3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MBD3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MBD3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MBD3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MBD3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MBD3 em células tumorais com expressão de MBD3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.