MaxiKα Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402208-ACT

KCNMA1 codifica a subunidade α do canal MaxiKα (BK), um canal de K+ de grande condutância ativado por Ca2+ e por voltagem, que integra sinais intracelulares de Ca2+ com a despolarização da membrana para regular a excitabilidade celular. Ao moldar a repolarização do potencial de ação e controlar a pós-hiperpolarização, o MaxiKα influencia a liberação de neurotransmissores, o tônus do músculo liso, a secreção endócrina e a reatividade vascular. O canal é funcionalmente acoplado a microdomínios de Ca2+ e a vias de sinalização que ajustam o fluxo iónico, o potencial de membrana e a homeostase de Ca2+, incluindo interações com subunidades auxiliares β/γ que modulam a cinética de abertura/fecho. A atividade desregulada de KCNMA1 tem sido associada a fenótipos de excitabilidade neurológica, disfunção do músculo liso vascular e das vias aéreas, e a programas alterados de proliferação celular relevantes para a investigação em eletrofisiologia e canalopatias iónicas.

MaxiKα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNMA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MaxiKα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNMA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNMA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MaxiKα. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNMA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MaxiKα no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MaxiKα em células tumorais com expressão de KCNMA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.