MARCKS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400837-ACT

O substrato da proteína quinase C rico em alanina miristoilado (MARCKS) é um importante substrato de PKC que se associa à membrana plasmática e ao citoesqueleto de actina para regular a forma celular, a adesão e a motilidade. Ao ligar-se ao fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) e promover a ligação cruzada de F-actina, o MARCKS influencia o tráfego de membranas, a exocitose/endocitose e a transdução de sinais a jusante de PKC e de Ca2+/calmodulina. A remodelação do citoesqueleto dependente de MARCKS está implicada no crescimento de neuritos e na plasticidade sináptica, bem como na migração de células imunitárias e na sinalização inflamatória. A expressão ou fosforilação desregulada de MARCKS tem sido relatada em contextos de biologia do cancro, neuroinflamação e doença pulmonar, sustentando a sua utilização como um nó mecanístico em estudos de migração, invasão e sinalização dependente de estímulos.

MARCKS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MARCKS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MARCKS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MARCKS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MARCKS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MARCKS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MARCKS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MARCKS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MARCKS em células tumorais com expressão de MARCKS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.