MARCH6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-437273-ACT

A MARCH6 humana codifica uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING-CH associada à membrana, localizada principalmente no retículo endoplasmático, onde coordena a renovação dependente de ubiquitina de proteínas de membrana mal dobradas ou reguladas. Ela participa da degradação associada ao RE (ERAD) e de programas mais amplos de proteostase ao acoplar o reconhecimento de substratos à ubiquitinação e à eliminação pelo proteassoma, influenciando assim vias de homeostase de lipídios e esteróis. Por meio da modulação do controle de qualidade proteica e da sinalização metabólica, alterações na atividade de MARCH6 podem remodelar respostas celulares ao estresse e programas transcricionais downstream relevantes para crescimento desregulado e inflamação. Essas funções tornam a MARCH6 um alvo útil para estudos mecanísticos que conectam sinalização por ubiquitina, estresse do RE e remodelação metabólica em modelos celulares relevantes para doenças.

MARCH6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MARCH6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MARCH6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MARCH6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MARCH6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MARCH6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MARCH6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MARCH6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MARCH6 em células tumorais com expressão de MARCH6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.