mAChR M5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402943-ACT

CHRM5 codifica o receptor muscarínico humano de acetilcolina M5 (mAChR M5), um receptor acoplado à proteína G que se acopla preferencialmente a Gq/11 para estimular a sinalização da fosfolipase C, a produção de fosfatos de inositol, a mobilização intracelular de Ca2+ e a ativação da proteína quinase C. Por meio dessas vias, o mAChR M5 modula a excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica, com papéis adicionais no tônus vascular e em processos secretórios, dependendo do contexto celular. A sinalização regulada por CHRM5 interage com MAPK/ERK e outras redes de segundos mensageiros que moldam a expressão gênica e respostas celulares adaptativas. A desregulação da sinalização colinérgica mediada por GPCRs tem sido associada a fenótipos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos, bem como a processos cardiometabólicos e inflamatórios, tornando o CHRM5 um ponto útil para estudos mecanísticos de acoplamento de vias e de programas transcricionais dirigidos por receptores.

mAChR M5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CHRM5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

mAChR M5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CHRM5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CHRM5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de mAChR M5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CHRM5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de mAChR M5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via mAChR M5 em células tumorais com expressão de CHRM5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.