mAChR M4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402318-ACT

CHRM4 codifica o receptor muscarínico humano de acetilcolina M4 (mAChR M4), um GPCR acoplado a Gi/o que modula a excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica ao inibir a adenilil ciclase, reduzir a sinalização por AMPc e regular a atividade de canais iônicos. O M4 participa das vias de neurotransmissão colinérgica e molda a saída dos circuitos dopaminérgicos por meio de mecanismos de sinalização pré-sinápticos e pós-sinápticos. Entre os efeitos a jusante estão a modulação da sinalização MAPK/ERK, da dinâmica do cálcio e da liberação de neurotransmissores, ligando a atividade de CHRM4 ao controle, em nível de rede, de processos motores e cognitivos. Alterações na sinalização de receptores muscarínicos e a desregulação de circuitos associada a CHRM4 têm sido estudadas em pesquisas sobre transtornos neuropsiquiátricos e distúrbios do movimento, incluindo contextos relevantes para a esquizofrenia, circuitos parkinsonianos e fenótipos relacionados ao uso de substâncias.

mAChR M4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CHRM4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

mAChR M4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CHRM4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CHRM4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de mAChR M4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CHRM4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de mAChR M4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via mAChR M4 em células tumorais com expressão de CHRM4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.