LysRS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404110-ACT

KARS codifica a lisil‑tRNA sintetase humana (LysRS), uma enzima citosólica central que carrega o tRNALys com lisina para garantir fidelidade traducional e síntese proteica eficiente. Ao conectar a disponibilidade de aminoácidos à função do ribossomo, a LysRS contribui para a proteostase e para respostas integradas ao estresse, e tem sido implicada em funções de sinalização não canônicas que coordenam a adaptação celular ao estresse. Alterações na atividade das aminoacil‑tRNA sintetases têm sido associadas a fenótipos de neurodesenvolvimento e neurodegeneração, neuropatias periféricas e distúrbios mitocondriais/relacionados à tradução, tornando KARS um nó relevante para o estudo de relações genótipo–fenótipo. Assim, KARS é amplamente utilizado em estudos mecanísticos de controle da tradução, regulação do crescimento celular e vias associadas ao estresse.

LysRS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KARS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LysRS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KARS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KARS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LysRS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KARS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LysRS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LysRS em células tumorais com expressão de KARS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.