LITAF Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-425275-ACT

O LITAF murino (fator de TNF induzido por lipopolissacarídeo) é um regulador transcricional e uma proteína adaptadora implicada na sinalização da imunidade inata e na expressão de genes inflamatórios. Ele participa de vias a jusante da estimulação de receptores Toll-like, influenciando programas de TNF e de outras citocinas e interagindo com o tráfego endossomal e com processos dependentes de ubiquitina que modulam a renovação (turnover) de receptores. A atividade do LITAF tem sido associada à regulação de respostas ligadas ao NF-κB e ao remodelamento transcricional induzido por estresse em macrófagos e em outros tipos celulares relevantes para o sistema imune. A desregulação da sinalização de LITAF tem sido estudada em contextos de inflamação crônica e biologia de infecções, e suas funções celulares também são relevantes para modelos de neuroinflamação e mecanismos de neuropatia periférica.

LITAF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Litaf sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LITAF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Litaf em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Litaf, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LITAF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Litaf nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LITAF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LITAF em células tumorais com expressão de Litaf silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.