LIS1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402193-ACT

O PAFAH1B1 humano codifica a LIS1, uma proteína reguladora da dineína essencial para o transporte baseado em microtúbulos, a orientação do fuso mitótico e a migração nuclear durante o neurodesenvolvimento. A LIS1 coordena a atividade da dineína citoplasmática e da dinactina para sustentar a proliferação de progenitores neuronais, a migração neuronal e a laminação cortical adequada. Por meio desses processos, o PAFAH1B1 influencia a organização do citoesqueleto, a função do centrossomo e vias de tráfego intracelular que moldam a polaridade celular e a arquitetura tecidual. A disrupção ou a alteração de dosagem do PAFAH1B1 está fortemente associada a transtornos do espectro da lisencefalia e a outros fenótipos do neurodesenvolvimento, tornando a LIS1 um alvo central para estudos mecanísticos da corticogênese e da dinâmica impulsionada pela dineína.

LIS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PAFAH1B1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LIS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PAFAH1B1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PAFAH1B1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LIS1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PAFAH1B1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LIS1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LIS1 em células tumorais com expressão de PAFAH1B1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.