LGR4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-430724-ACT

Lgr4 codifica o receptor acoplado à proteína G contendo repetições ricas em leucina 4 (LGR4), um receptor de membrana que potencializa a sinalização WNT/β-catenina por meio da ligação às R-spondinas e da modulação da atividade de RNF43/ZNRF3. Em tecidos de camundongo, o LGR4 ajuda a regular a manutenção de células-tronco e progenitoras, as interações epitélio–mesênquima e a organogênese, com efeitos a jusante sobre programas transcricionais que controlam proliferação e diferenciação. A atividade do LGR4 interage com vias de desenvolvimento e de homeostase, incluindo comunicação cruzada com redes de sinalização de fatores de crescimento e inflamatórias que moldam o remodelamento tecidual. A desregulação do eixo LGR4–WNT tem sido associada a fenótipos relevantes para a biologia óssea e reprodutiva, a manutenção do epitélio intestinal e contextos de sinalização associados a tumores, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos de vias.

LGR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Lgr4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LGR4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Lgr4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Lgr4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LGR4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Lgr4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LGR4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LGR4 em células tumorais com expressão de Lgr4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.