LEKTI Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402594-ACT

O SPINK5 codifica o inibidor relacionado ao tipo Kazal linfoepitelial (LEKTI), um inibidor de proteases serinas multidomínio que restringe as calicreínas epidérmicas para manter a coesão do estrato córneo, o controle da descamação e a integridade da barreira. Ao modular o processamento dependente de proteases de componentes dos corneodesmossomos, o LEKTI influencia programas de diferenciação de queratinócitos e cascatas de sinalização inflamatória na epiderme. A atividade alterada de SPINK5/LEKTI está associada à função prejudicada da barreira cutânea e a uma maior suscetibilidade à inflamação cutânea, tornando-o relevante para estudos de homeostase epitelial e do equilíbrio protease–antiprotease. Além da pele, os perfis de expressão de SPINK5 podem orientar pesquisas sobre respostas epiteliais ao estresse e remodelamento impulsionado por proteólise em tecidos de barreira.

LEKTI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPINK5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LEKTI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPINK5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPINK5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LEKTI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPINK5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LEKTI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LEKTI em células tumorais com expressão de SPINK5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.