Legumain Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402437-ACT

O gene humano LGMN codifica a legumaina, uma endopeptidase lisossomal asparaginil que promove o processamento proteolítico de substratos intracelulares e extracelulares em condições ácidas. A legumaina participa da renovação de proteínas no sistema endolisossomal, de vias de processamento de antígenos em células imunes e da remodelação da matriz extracelular por meio da ativação de outras proteases e da clivagem de proteínas associadas à matriz. A desregulação da expressão e da atividade de LGMN tem sido associada à inflamação, fibrose e à biologia do microambiente tumoral, em que redes de proteases alteradas podem influenciar a invasão, a angiogênese e a modulação imune. Como resultado, LGMN é amplamente estudado em função lisossomal, proteostase e sinalização mediada por proteases, relevantes para contextos de câncer e neuroinflamação.

Legumain O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LGMN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Legumain O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LGMN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LGMN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Legumain. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LGMN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Legumain no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Legumain em células tumorais com expressão de LGMN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.