KRAS Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421333-ACT

Kras codifica a pequena GTPase KRAS, um interruptor molecular central que transmite sinais a partir de receptores tirosina-quinase ativados para as vias downstream RAF–MEK–ERK e PI3K–AKT–mTOR. Ao alternar entre os estados ligados a GDP e a GTP, KRAS regula proliferação, diferenciação, sobrevivência e adaptação metabólica, com controle rigoroso por GEFs e GAPs. A sinalização de KRAS desregulada perturba o controle do ciclo celular e programas de resposta ao estresse e é amplamente utilizada em modelos murinos para investigar redes de sinalização oncogênica, homeostase tecidual e interações entre tumor e microambiente. Como KRAS integra múltiplos estímulos a montante e coordena uma ampla gama de desfechos transcricionais e pós-traducionais, é um nó-chave para mapeamento de vias e estudos de epistasia.

KRAS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Kras sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KRAS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Kras em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Kras, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KRAS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Kras nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KRAS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KRAS em células tumorais com expressão de Kras silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.