KMO Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-418366-ACT

A KMO (quinurenina 3-monooxigenase) humana é uma enzima mitocondrial dependente de flavina na via da quinurenina do catabolismo do triptofano, catalisando a conversão de L-quinurenina em 3-hidroxiquinurenina. Ao controlar o fluxo em direção a metabólitos a jusante, como o ácido 3-hidroxiantranílico e o ácido quinolínico, a KMO influencia o balanço redox celular, a biossíntese de NAD+ e a sinalização neuroimune. Alterações na atividade da KMO podem deslocar os níveis de metabólitos neuroativos e oxidativos, associando essa via a processos ligados à inflamação e a mecanismos de doenças neurológicas. A expressão de KMO também é estudada em contextos de estresse metabólico e regulação imune, nos quais a remodelação da via da quinurenina impacta transições de estado celular.

KMO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KMO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KMO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KMO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KMO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KMO. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KMO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KMO no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KMO em células tumorais com expressão de KMO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.