Klotho Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400970-ACT

KL codifica a Klotho, uma proteína transmembranar do tipo I que atua como co-receptor obrigatório para a sinalização endócrina de FGF, com destaque para o FGF23, regulando a homeostase do fosfato e da vitamina D. A Klotho ligada à membrana também modula diversos nós de sinalização, incluindo as vias de insulina/IGF-1, Wnt/β-catenina e TGF-β, influenciando respostas ao estresse oxidativo, senescência celular e remodelamento da matriz extracelular. Um ectodomínio solúvel de Klotho, gerado por clivagem (shedding), pode atuar de maneira parácrina/endócrina, afetando a atividade de canais iônicos e a sinalização de fatores de crescimento em diversos tecidos. A desregulação da expressão de KL tem sido associada a fenótipos relacionados ao envelhecimento e tem sido estudada em contextos como doença renal crônica, remodelamento cardiovascular, disfunção metabólica e neurodegeneração, como um elo mecanístico entre o metabolismo mineral e a homeostase tecidual.

Klotho O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Klotho O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Klotho. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Klotho no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Klotho em células tumorais com expressão de KL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.