KGA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402575-ACT

O gene humano **GLS** codifica a glutaminase, sendo a isoforma de glutaminase do tipo renal **KGA** responsável por catalisar, na mitocôndria, a conversão de glutamina em glutamato e amónia, um passo-chave na glutaminólise. Esta reação sustenta a anaplerose do ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs), o processamento do azoto e a biossíntese de nucleótidos, aminoácidos e glutationa, ligando a atividade de GLS ao equilíbrio redox e às respostas celulares ao stress. A KGA integra-se com programas de deteção de nutrientes, como a sinalização **mTORC1**, e interage com a regulação metabólica dirigida por **MYC**, moldando a proliferação e a sobrevivência sob disponibilidade variável de nutrientes. A expressão ou atividade desregulada de GLS/KGA tem sido associada à remodelação metabólica no cancro e a alterações da homeostase do glutamato em contextos neurológicos e inflamatórios, tornando-a um nó central para estudos mecanísticos de fenótipos dependentes do metabolismo.

KGA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GLS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KGA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GLS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GLS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KGA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GLS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KGA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KGA em células tumorais com expressão de GLS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.