KCNQ2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402492-ACT

KCNQ2 codifica la subunità Kv7.2 di un canale del potassio voltaggio-dipendente, componente fondamentale delle correnti neuronali di tipo M (K+) che stabilizzano il potenziale di membrana e limitano la scarica ripetitiva. Modellando la soglia del potenziale d’azione e l’adattamento della frequenza di scarica, KCNQ2 influenza l’eccitabilità nei circuiti corticali e ippocampali e si integra con vie di segnalazione che modulano il gating e il traffico del canale, inclusa la regolazione dipendente dai fosfoinositidi a livello della membrana plasmatica. L’alterazione della funzione o dell’espressione di KCNQ2 è fortemente associata a disturbi dello spettro epilettico e a fenotipi neuroevolutivi, rendendolo un locus ampiamente utilizzato per studiare la biologia dei canali ionici, la dinamica delle reti sinaptiche e le relazioni genotipo–fenotipo in modelli neuronali umani.

KCNQ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNQ2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCNQ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNQ2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNQ2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCNQ2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNQ2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCNQ2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCNQ2 nelle cellule tumorali con espressione di KCNQ2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.