KCC4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422974-ACT

Slc12a7 codifica o cotransportador K+-Cl− KCC4 (SLC12A7) de camundongo, um regulador-chave da extrusão eletroneutra de cloreto que ajuda a definir os níveis intracelulares de Cl−, o volume celular e a homeostase iônica. Ao moldar os gradientes de Cl−, o KCC4 influencia a excitabilidade de membrana e a sinalização inibitória e se conecta a respostas ao estresse osmótico e a programas de remodelamento do citoesqueleto ligados à migração e à invasão celular. A atividade do KCC4 também está acoplada ao transporte iônico epitelial e à regulação de pH/volume, processos que podem afetar a função de barreira dos tecidos e a sinalização do microambiente. A expressão desregulada de SLC12A7 tem sido associada a fenótipos alterados de motilidade e remodelamento em contextos relevantes para doenças, apoiando seu uso em estudos mecanísticos de comportamentos celulares dependentes do transporte iônico.

KCC4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Slc12a7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KCC4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Slc12a7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Slc12a7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KCC4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Slc12a7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KCC4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KCC4 em células tumorais com expressão de Slc12a7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.