KANK4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-414866-ACT

O KANK4 humano (domínios do motivo KN e de repetições de anquirina 4) codifica um adaptador do citoesqueleto que contribui para a coordenação entre microtúbulos corticais e actina e para as interações célula–matriz. Por meio de interações dependentes do motivo KN com membros da família das cinesinas e de ligação a proteínas mediada por repetições de anquirina, o KANK4 está associado à dinâmica das adesões focais, à polaridade celular e à migração direcional, processos que moldam a arquitetura tecidual e a mecanotransdução. Proteínas da família KANK têm sido estudadas em vias envolvendo sinalização por Rho GTPases, turnover de adesão e remodelamento do citoesqueleto, tornando o KANK4 relevante para investigações de comportamento invasivo e de fenótipos de motilidade celular alterados. A expressão desregulada ou alterações genômicas de reguladores do citoesqueleto/adesão, incluindo KANK4, são frequentemente examinadas em biologia do câncer e em contextos do desenvolvimento nos quais programas de migração e adesão estão perturbados.

KANK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KANK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KANK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KANK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KANK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KANK4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KANK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KANK4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KANK4 em células tumorais com expressão de KANK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.