IRP-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401710-ACT

O IREB2 humano codifica a proteína reguladora do ferro 2 (IRP-2), um regulador pós-transcricional central da homeostase do ferro que se liga a elementos responsivos ao ferro (IREs) em mRNAs-alvo para coordenar a captação, o armazenamento e a utilização de ferro. Ao modular transcritos como o receptor de transferrina e a ferritina, a IRP-2 conecta a disponibilidade celular de ferro ao metabolismo mitocondrial, à síntese de heme e ao equilíbrio redox. A atividade da IRP-2 cruza-se com a sinalização de estresse oxidativo e com programas responsivos à hipóxia, influenciando a proteostase e a função mitocondrial. A desregulação da sinalização IREB2/IRP-2 tem sido associada a alterações no manejo de ferro e a vias de lesão oxidativa implicadas na neurodegeneração e em outras fisiopatologias relacionadas ao ferro.

IRP-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IREB2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IRP-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IREB2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IREB2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IRP-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IREB2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IRP-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IRP-2 em células tumorais com expressão de IREB2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.