IRE1α Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400576-ACT

ERN1 codifica a enzima 1 alfa dependente de inositol (IRE1α), uma quinase/endoribonuclease transmembrana residente no retículo endoplasmático (RE) que atua como sensor central da carga de proteínas mal dobradas e inicia a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR). Sob estresse do RE, a IRE1α oligomeriza e ativa sua atividade de RNase para realizar o splicing do mRNA de XBP1 e promover programas transcricionais adaptativos, ao mesmo tempo em que aciona a degradação regulada dependente de IRE1 (RIDD) para modular a homeostase de mRNA. Por meio de interações com as vias de sinalização de PERK e ATF6, ERN1 coordena a proteostase, o metabolismo lipídico e a sinalização inflamatória, influenciando decisões de destino celular entre adaptação e apoptose. A atividade desregulada do eixo IRE1α–XBP1 tem sido implicada em contextos como a sobrevivência de células tumorais sob estresse, disfunção metabólica e neurodegeneração, tornando ERN1 um alvo amplamente utilizado em estudos mecanísticos da biologia do estresse do RE.

IRE1α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ERN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IRE1α O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ERN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ERN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IRE1α. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ERN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IRE1α no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IRE1α em células tumorais com expressão de ERN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.