IP3R-III Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421194-ACT

Itpr3 codifica o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 3 (IP3R-III) do camundongo, um canal de liberação de Ca²⁺ do retículo endoplasmático que conecta a sinalização via GPCR/PLC a oscilações de cálcio intracelular. O fluxo de Ca²⁺ mediado por IP3R-III regula a secreção, a polaridade epitelial, o metabolismo mitocondrial e a sinalização apoptótica, integrando a dinâmica do cálcio a programas transcricionais dependentes de MAPK e NFAT. Alterações na expressão de IP3R-III ou na homeostase de cálcio têm sido associadas à desregulação da diferenciação epitelial e das respostas ao estresse, tornando Itpr3 um alvo útil para estudar circuitos de sinalização por cálcio relevantes para inflamação e fenótipos associados a tumores.

IP3R-III O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Itpr3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IP3R-III O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Itpr3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Itpr3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IP3R-III. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Itpr3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IP3R-III no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IP3R-III em células tumorais com expressão de Itpr3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.