IP3R-III Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402138-ACT

ITPR3 codifica o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 3 (IP3R-III), um canal de liberação de Ca²⁺ do retículo endoplasmático que se abre em resposta ao IP3 gerado a jusante da sinalização da fosfolipase C. Ao modular oscilações intracelulares de Ca²⁺ e a sinalização em microdomínios, o IP3R-III regula a secreção, a polaridade epitelial, o metabolismo mitocondrial e programas de transcrição dependentes de Ca²⁺. A função do IP3R-III se integra a vias de GPCRs e de receptores tirosina-quinase, acoplando sinais extracelulares à dinâmica de Ca²⁺ no RE e a efetores a jusante, como quinases dependentes de calmodulina e a sinalização de NFAT. Alterações na expressão de ITPR3 ou na homeostase de Ca²⁺ têm sido associadas a proliferação desregulada, respostas ao estresse e remodelamento epitelial em múltiplos contextos relevantes para doenças, sustentando estudos mecanísticos de redes de sinalização de Ca²⁺.

IP3R-III O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITPR3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IP3R-III O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITPR3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITPR3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IP3R-III. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITPR3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IP3R-III no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IP3R-III em células tumorais com expressão de ITPR3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.