IP3R-II Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421193-ACT

O Itpr2 de camundongo codifica o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 2 (IP3R-II), um canal de liberação de Ca²⁺ do retículo endoplasmático que converte sinais de IP3 em transientes de cálcio citosólico. O IP3R-II atua a jusante de vias de GPCR e de receptores tirosina-quinase que estimulam a fosfolipase C, modulando processos dependentes de Ca²⁺ como secreção, contração, metabolismo e respostas transcricionais. Ao regular a dinâmica espaço-temporal de Ca²⁺ e a homeostase de Ca²⁺ no RE, o Itpr2 influencia a sinalização entre organelas e respostas ao estresse que frequentemente são alteradas na fisiopatologia. A desregulação da sinalização de cálcio mediada por IP3R tem sido implicada em diversos mecanismos relevantes para doenças, incluindo excitabilidade alterada, defeitos no transporte epitelial e perturbações da homeostase celular em contextos neurológicos e endócrinos.

IP3R-II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Itpr2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IP3R-II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Itpr2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Itpr2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IP3R-II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Itpr2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IP3R-II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IP3R-II em células tumorais com expressão de Itpr2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.