IP3R-II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401067-ACT

ITPR2 codifica o receptor humano de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 2 (IP3R-II), um canal de liberação de Ca2+ localizado na membrana do retículo endoplasmático (RE) que converte sinais de IP3, a jusante da fosfolipase C, em transientes de cálcio no citosol. O fluxo de cálcio mediado por IP3R-II molda o acoplamento excitação–contração, a secreção, o metabolismo e programas transcricionais por meio de efetores dependentes de Ca2+, como calmodulina, CaMK, calcineurina/NFAT e a captação mitocondrial de cálcio. Esse nó de sinalização integra entradas de vias de GPCR e de receptores tirosina-quinase e contribui para o acoplamento de cálcio entre organelas em sítios de contato RE–mitocôndria. A atividade desregulada de IP3R-II e a homeostase alterada do cálcio têm sido implicadas em estudos mecanísticos de fisiologia cardiovascular e epitelial e em pesquisas sobre distúrbios envolvendo sinalização aberrante de cálcio, incluindo fenótipos associados a arritmias e contextos de sinalização proliferativa ou inflamatória.

IP3R-II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITPR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IP3R-II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITPR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITPR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IP3R-II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITPR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IP3R-II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IP3R-II em células tumorais com expressão de ITPR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.