Intersectin-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402531-ACT

ITSN2 codifica a intersectina-2, uma proteína de suporte endocítico com múltiplos domínios que integra o tráfego de membrana mediado por clatrina com respostas de sinalização por meio de interações mediadas por SH3 com reguladores de dinamina, remodelamento de actina e pequenas GTPases. Ao coordenar endocitose, reciclagem de vesículas e dinâmica do citoesqueleto, a intersectina-2 contribui para a internalização de receptores, programas de tráfego sináptico e neuronal e o controle espacial da transdução de sinais. Perturbações na rede associada ao ITSN2 têm sido relacionadas na literatura a alterações na sinalização por fatores de crescimento e a defeitos na dinâmica de membrana, relevantes para a biologia do câncer e processos do neurodesenvolvimento. Sua arquitetura modular torna o ITSN2 um nó útil para dissecar a comunicação cruzada entre vias de tráfego e cascatas de sinalização impulsionadas por quinases.

Intersectin-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITSN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Intersectin-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITSN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITSN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Intersectin-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITSN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Intersectin-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Intersectin-2 em células tumorais com expressão de ITSN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.