Int-6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405759-ACT

O EIF3E humano (Int-6) codifica uma subunidade conservada do complexo do fator de iniciação da tradução eucariótico 3 (eIF3), dando suporte ao início da tradução dependente de cap e coordenando o recrutamento de mRNA para a subunidade ribossômica 40S. Além do controle da tradução, o Int-6 tem sido associado à proteostase e à transdução de sinais por meio de interações que acoplam a síntese proteica à dinâmica do sistema ubiquitina–proteassoma e a programas responsivos ao estresse. A atividade de EIF3E influencia a progressão do ciclo celular, a diferenciação e respostas adaptativas ao estresse celular, tornando-o relevante para estudos de reprogramação translacional. A desregulação da expressão de EIF3E ou do equilíbrio do complexo eIF3 tem sido associada a alterações no controle do crescimento e em contextos de sinalização oncogênica, o que motiva pesquisas mecanísticas em biologia do câncer e patologias relacionadas.

Int-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EIF3E sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Int-6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EIF3E em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EIF3E, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Int-6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EIF3E nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Int-6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Int-6 em células tumorais com expressão de EIF3E silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.