Insulin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400149-ACT

O INS humano codifica a insulina, um hormônio peptídico sintetizado como pré-proinsulina em células β pancreáticas e processado, por meio do tráfego secretório RE–Golgi, em insulina madura e peptídeo C. A ligação ao receptor de insulina ativa as vias de sinalização PI3K–AKT e MAPK, coordenando a captação de glicose, o metabolismo do glicogênio e dos lipídios e programas anabólicos mais amplos no fígado, no músculo e no tecido adiposo. A desregulação da expressão de INS, do processamento da proinsulina ou da sinalização da insulina contribui para a homeostase glicêmica comprometida e é central na fisiopatologia relacionada ao diabetes e nas respostas de estresse das células β. O INS também é amplamente utilizado como marcador de identidade endócrina e de acoplamento estímulo-secreção em modelos de desenvolvimento pancreático, inflamação metabólica e diferenciação celular.

Insulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de INS sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Insulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus INS em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição INS, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Insulin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus INS nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Insulin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Insulin em células tumorais com expressão de INS silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.