INSIG-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402255-ACT

INSIG2 codifica a INSIG-2, uma proteína de membrana do retículo endoplasmático que limita a ativação da proteína ligadora do elemento regulador de esteróis (SREBP) ao promover a retenção do complexo SCAP–SREBP no RE em condições de abundância de esteróis. Por meio desse ponto de controle de detecção de esteróis, a INSIG-2 ajuda a coordenar a biossíntese de colesterol e ácidos graxos com a disponibilidade de lipídios na célula e interage com vias de ubiquitinação associadas ao RE que regulam enzimas metabólicas. Alterações na expressão ou na função de INSIG2 têm sido associadas à lipogênese desregulada e à homeostase do colesterol, com relatos de associação a fenótipos metabólicos, incluindo resistência à insulina, características relacionadas à obesidade e acúmulo de lipídios hepáticos. Como nó de via, a INSIG-2 é amplamente utilizada para investigar o controle transcricional do metabolismo lipídico, a interação entre estresse do RE e metabolismo e a regulação por feedback de genes-alvo de SREBP.

INSIG-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de INSIG2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

INSIG-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus INSIG2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição INSIG2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de INSIG-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus INSIG2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de INSIG-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via INSIG-2 em células tumorais com expressão de INSIG2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.