ILT-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403335-ACT

O LILRB1 humano codifica o ILT-2 (LIR-1/CD85j), um imunorreceptor inibitório expresso em células NK, monócitos, células dendríticas e em subpopulações de células T e B, que se liga a moléculas de HLA de classe I clássicas e não clássicas, incluindo o HLA-G. Após a ligação ao ligante, o ILT-2 sinaliza por meio de motivos ITIM para recrutar as fosfatases SHP-1/SHP-2, atenuando vias de receptores ativadores e reduzindo a citotoxicidade, a produção de citocinas e a maturação de células apresentadoras de antígeno. Essa sinalização, semelhante a um checkpoint, molda a tolerância imunológica nas interfaces teciduais e modula respostas à infecção e ao estresse celular. A atividade desregulada de LILRB1/ILT-2 tem sido implicada em alterações da regulação imune em contextos inflamatórios e autoimunes e em mecanismos de evasão imune em microambientes de doenças.

ILT-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LILRB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ILT-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LILRB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LILRB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ILT-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LILRB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ILT-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ILT-2 em células tumorais com expressão de LILRB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.